MISE AU POINT D’UNE MÉTHODE D’ANALYSE CHROMATOGRAPHIQUE COMMUNE À LA MÉTHACHOLINE, LE BÉTHANÉCHOL ET LEURS SUBSTANCES APPARENTÉES
Réf. 039 PT
Morgane RENAULT-MAHIEUX1, Gaëtan BOCCADIFUOCCO1, Pauline LEGRAND1, Bruno LAGES1, Sophie DUFAY1, Véronique PLANAS1
1 : Département Laboratoires, Agence Générale des Equipements et Produits de Santé, 7 rue du Fer à Moulin, 75005 Paris
Résumé du poster
Introduction : Le chlorure de méthacholine (MCh) en solution aqueuse à reconstituer extemporanément avec un tampon phosphate et le chlorure de béthanéchol (BC) en pilulier sont deux préparations hospitalières. La MCh permet le diagnostic d’une hyperréactivité bronchique non spécifique tandis que le BC sert au traitement du reflux gastro-oesophagien primaire de l’enfant et du nourrisson. Les bonnes pratiques de fabrication demandent des contrôles sur les matières premières (MP), les produits finis (PF) ainsi que des études de stabilité sans en préciser les modalités. Le dosage de la MCh, du BC et leurs impuretés de dégradation, la bétaméthylcholine (βMC) et l’ammonium, étaient réalisées par 5 méthodes d’analyse différentes, dont 4 en chromatographie liquide haute performance avec des temps d’analyse et de conditionnement de colonnes et de détecteurs très longs. Les structures de la MCh et du BC étant proches, l’objectif de ce travail était de mettre au point une méthode d’analyse commune pour ces deux composés et leurs substances apparentées, afin d’optimiser les temps analytique et de gagner en productivité.
Matériels & méthode : Les séparations de la MCh, du BC, de la βMC et de l’ammonium ont été réalisées sur 2 colonnes échangeuses de cations IonPac® CS14 et CS17 (150x4,0 mm, 8 et 7 µm respectivement) thermostatées à 30°C avec différentes phases mobiles (PM) composées d’acide méthanesulfonique (MSA) de 2,60 à 50 mM en isocratique ou en gradient, à un débit de 1 mL/min. Le volume d’injection était de 20 µL pour les analyses (dosage et impuretés) concernant la MCh et de 25 µL pour celles du BC. La détection était conductimétrique. Pour chacune des conditions testées, la spécificité, la résolution, l’efficacité et le temps d’analyse ont été étudiés, ainsi que la répétabilité et la linéarité pour les plus satisfaisantes.
Résultats & discussion : Aucune PM utilisée sur la CS14 n’a permis d’obtenir une efficacité satisfaisante. Les méthode USP de dosage de la MCh et de ses substances apparentées (CS17, MSA 5,20 mM, 1 mL/min) ont donné les meilleurs résultats avec une bonne efficacité pour la MCh et le BC (3278 et 4882 plateaux théoriques), une bonne résolution (supérieure à 1,5), un temps d’analyse inférieur à 20 minutes, ainsi qu’une bonne répétabilité : coefficients de variation des solutions standards du dosage MCh, de la βMC dans les impuretés MCh, du dosage BC et de la βMC dans les impuretés BC respectivement de 0,90%, 6,59%, 1,32% et 0,22% (n = 5), soit dans les limites définies par les monographies USP de la MCh et du BC. L’ammonium n’a pu être séparé des pics présents dans le chromatogramme du solvant de dilution. Le passage d’une gamme de 40 à 60 µg/mL de MCh a permis d’obtenir un coefficient de détermination de 0,999. Un effet mémoire a été observé pouvant influencer l’essai de teneur limite en impuretés, et nécessite donc l’injection de quelques blancs entre les échantillons à analyser. Il n’y a pas d’excipients dans les produits finis pouvant influencer la méthode de dosage. La mise au point étant finalisée, la méthode pourra être validée par la suite.
Conclusion : Une seule méthode analytique optimisée a été développée pour le contrôle de la MCh et du BC (MP et PF), excepté pour l’impureté ammonium. En utilisant une unique PM, ce qui réduira les durées de conditionnement de la colonne, elle permettra un gain de temps analytique et d’efficacité.
Mots clés : Contrôles analytiques, CLHP, Préparations pharmaceutiques, Méthacholine, Béthanéchol
Matériels & méthode : Les séparations de la MCh, du BC, de la βMC et de l’ammonium ont été réalisées sur 2 colonnes échangeuses de cations IonPac® CS14 et CS17 (150x4,0 mm, 8 et 7 µm respectivement) thermostatées à 30°C avec différentes phases mobiles (PM) composées d’acide méthanesulfonique (MSA) de 2,60 à 50 mM en isocratique ou en gradient, à un débit de 1 mL/min. Le volume d’injection était de 20 µL pour les analyses (dosage et impuretés) concernant la MCh et de 25 µL pour celles du BC. La détection était conductimétrique. Pour chacune des conditions testées, la spécificité, la résolution, l’efficacité et le temps d’analyse ont été étudiés, ainsi que la répétabilité et la linéarité pour les plus satisfaisantes.
Résultats & discussion : Aucune PM utilisée sur la CS14 n’a permis d’obtenir une efficacité satisfaisante. Les méthode USP de dosage de la MCh et de ses substances apparentées (CS17, MSA 5,20 mM, 1 mL/min) ont donné les meilleurs résultats avec une bonne efficacité pour la MCh et le BC (3278 et 4882 plateaux théoriques), une bonne résolution (supérieure à 1,5), un temps d’analyse inférieur à 20 minutes, ainsi qu’une bonne répétabilité : coefficients de variation des solutions standards du dosage MCh, de la βMC dans les impuretés MCh, du dosage BC et de la βMC dans les impuretés BC respectivement de 0,90%, 6,59%, 1,32% et 0,22% (n = 5), soit dans les limites définies par les monographies USP de la MCh et du BC. L’ammonium n’a pu être séparé des pics présents dans le chromatogramme du solvant de dilution. Le passage d’une gamme de 40 à 60 µg/mL de MCh a permis d’obtenir un coefficient de détermination de 0,999. Un effet mémoire a été observé pouvant influencer l’essai de teneur limite en impuretés, et nécessite donc l’injection de quelques blancs entre les échantillons à analyser. Il n’y a pas d’excipients dans les produits finis pouvant influencer la méthode de dosage. La mise au point étant finalisée, la méthode pourra être validée par la suite.
Conclusion : Une seule méthode analytique optimisée a été développée pour le contrôle de la MCh et du BC (MP et PF), excepté pour l’impureté ammonium. En utilisant une unique PM, ce qui réduira les durées de conditionnement de la colonne, elle permettra un gain de temps analytique et d’efficacité.
Mots clés : Contrôles analytiques, CLHP, Préparations pharmaceutiques, Méthacholine, Béthanéchol