MISE AU POINT ET OPTIMISATION D’UNE MÉTHODE DE DOSAGE DE LA MÉTHIONINE PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE-ULTRAVIOLET (HPLC-UV)
Réf. 024 PT
Amandine LE DALLIC1, Augustin PINARD2, Rand BLAYBEL1, Caroline JASKOWIEC1, Stéphanie POULLAIN1
1 : Pharmacie, Centre Hospitalier Intercommunal de Créteil, 40 Av. de Verdun, 94000 Créteil
2 : Pharmacie, Henri-Mondor AP-HP, 1 Rue Gustave Eiffel, 94000 Créteil
2 : Pharmacie, Henri-Mondor AP-HP, 1 Rue Gustave Eiffel, 94000 Créteil
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Résumé du poster
Introduction : Actuellement, la PUI prépare des mélanges de nutrition parentérale standards pour le service de réanimation néonatale. La durée de conservation des mélanges est limitée à 4 jours du fait de l´instabilité de certains acides aminés comme la méthionine. Dans la perspective d’étendre la conservation des préparations, il est envisagé d’étudier la stabilité des acides aminés les plus instables présents dans les MNPS et notamment la méthionine. L’objectif est la mise au point et l’optimisation d’une méthode de dosage de la méthionine par Chromatographie Liquide Haute Performance-Ultraviolet (HPLC-UV) pour pouvoir doser les AAs dans les MNPS.
Matériels & méthode : Pour générer un signal en UV détectable à 338nm, une réaction de dérivatisation de la méthionine en pré-colonne est réalisée à l’aide d’acide 3-mercaptopropionique (3-MPA) et d’ortho-phthalaldehyde (OPA), avec un tampon d’acide borique à 50 mM, pH 9,5. Une recherche bibliographique a été menée afin de mettre au point la technique de dosage. Des temps variables de réaction ont été testés (5,10 et 30 minutes) avec un mélange chauffé à 40°C à l’abri de la lumière. La séparation chromatographique s’effectue sur une colonne (Kinetex EVO C18 150mm*4,6mm*5µm), précédée d’une colonne de garde thermostatée à 30°C. Une phase aqueuse A (tampon KH2PO4 20mM, pH 7,2) et une phase organique B (acétonitrile/méthanol 50/50) constituent le gradient d’élution. Une fois le temps de réaction optimal déterminé selon les premiers résultats, la validation d’une gamme de méthionine allant de 2,08mg/ml à 3,12mg/ml est réalisée.
Résultats & discussion : Les gammes réalisées après 5 et 10 minutes de réactions sont linéaires bien qu’un point soit aberrant pour chacune d’elle et n’ait pas été pris en compte. De son côté, la gamme avec 30 minutes de réaction n’est pas linéaire et on observe même une décroissance paradoxale de l’AUC corrélée à l’augmentation de la concentration en méthionine. Du fait d’une AUC plus importante et d’une réaction plus complète le temps de réaction choisi pour réaliser la gamme est celui de 10 minutes. Sur les 2 gammes supplémentaires réalisées pour la seconde étape, une d’elles n’a pas pu être exploitée du fait d’un nombre de points aberrants trop importants. La 3ème gamme est quant à elle linéaire (R²=0.9237) mais avec des valeurs d’AUC présentant un grand écart avec celles de la 1ère gamme. Des coefficients de variation (10,7 % à 27,9 %) sont observés à chaque concentration. La recherche bibliographique préalable à cette étude retranscrit une grande variabilité des protocoles utilisés. La lourdeur des manipulations (protocole très précis, réactif neuf toutes les 4h, analyse de chaque échantillon possible une seule fois) associée à des résultats trop variables remet en question la faisabilité de cette étude de stabilité par cette méthode.
Conclusion : Les essais menés dans cette étude à partir d’une compilation de méthodes et protocoles n’ont pas permis de développer une méthode de dosage de la méthionine (linéaire mais coefficients de variation trop importants et points non analysables trop nombreux).
Mots clés : Nutrition parentérale, Méthionine, Acides aminés
Matériels & méthode : Pour générer un signal en UV détectable à 338nm, une réaction de dérivatisation de la méthionine en pré-colonne est réalisée à l’aide d’acide 3-mercaptopropionique (3-MPA) et d’ortho-phthalaldehyde (OPA), avec un tampon d’acide borique à 50 mM, pH 9,5. Une recherche bibliographique a été menée afin de mettre au point la technique de dosage. Des temps variables de réaction ont été testés (5,10 et 30 minutes) avec un mélange chauffé à 40°C à l’abri de la lumière. La séparation chromatographique s’effectue sur une colonne (Kinetex EVO C18 150mm*4,6mm*5µm), précédée d’une colonne de garde thermostatée à 30°C. Une phase aqueuse A (tampon KH2PO4 20mM, pH 7,2) et une phase organique B (acétonitrile/méthanol 50/50) constituent le gradient d’élution. Une fois le temps de réaction optimal déterminé selon les premiers résultats, la validation d’une gamme de méthionine allant de 2,08mg/ml à 3,12mg/ml est réalisée.
Résultats & discussion : Les gammes réalisées après 5 et 10 minutes de réactions sont linéaires bien qu’un point soit aberrant pour chacune d’elle et n’ait pas été pris en compte. De son côté, la gamme avec 30 minutes de réaction n’est pas linéaire et on observe même une décroissance paradoxale de l’AUC corrélée à l’augmentation de la concentration en méthionine. Du fait d’une AUC plus importante et d’une réaction plus complète le temps de réaction choisi pour réaliser la gamme est celui de 10 minutes. Sur les 2 gammes supplémentaires réalisées pour la seconde étape, une d’elles n’a pas pu être exploitée du fait d’un nombre de points aberrants trop importants. La 3ème gamme est quant à elle linéaire (R²=0.9237) mais avec des valeurs d’AUC présentant un grand écart avec celles de la 1ère gamme. Des coefficients de variation (10,7 % à 27,9 %) sont observés à chaque concentration. La recherche bibliographique préalable à cette étude retranscrit une grande variabilité des protocoles utilisés. La lourdeur des manipulations (protocole très précis, réactif neuf toutes les 4h, analyse de chaque échantillon possible une seule fois) associée à des résultats trop variables remet en question la faisabilité de cette étude de stabilité par cette méthode.
Conclusion : Les essais menés dans cette étude à partir d’une compilation de méthodes et protocoles n’ont pas permis de développer une méthode de dosage de la méthionine (linéaire mais coefficients de variation trop importants et points non analysables trop nombreux).
Mots clés : Nutrition parentérale, Méthionine, Acides aminés